PCO FLIM技术助力生命科学研究（1）：pco.flim相机成功用于脑瘤检测和级配研发

Macroscopic fluorescencelifetime imaging of NADH and protoporphyrin IX improves the detection and grading of 5aminolevulinic acidstained brain tumors

NADH 和原卟啉 IX 的宏观荧光寿命成像对 5-氨基乙酰丙酸染色脑肿瘤的检测和分级的改进

Mikael T. Erkkilä, David Reichert, Johanna Gesperger, Barbara Kiesel,

Thomas Roetzer, Petra A. Mercea, Wolfgang Drexler, Angelika Unterhuber,

Rainer A. Leitgeb, Adelheid Woehrer, Angelika Rueck, Marco Andreana1* &

Georg Widhalm

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-77268-8

Sci Rep 10, 20492 (2020).

Published 24 November 2020

【摘要翻译】

最大安全切除肿瘤仍然是改善脑肿瘤患者预后的关键因素。尽管有基于 5-氨基乙酰丙酸的荧光引导，但神经外科仍无法观察到大多数低级别神经胶质瘤 (LGG) 和高级别神经胶质瘤 (HGG) 的浸润区。为了满足对更灵敏的可视化的需求，我们研究了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 和原卟啉 IX (PPIX) 在选定的人类脑肿瘤中的宏观、宽场荧光寿命成像的潜力。若在未来的术中使用，成像系统在 250 毫米的自由工作距离下可提供 11 毫米的方形视野。我们对肿瘤组织进行了离体成像，包括 LGG 和 HGG 以及从 21 名接受荧光引导手术的患者脑中切除的脑转移瘤。所有样本中有一半在手术过程中显示出可见荧光，这与 PPIX 荧光寿命的显着增加有关。虽然 PPIX 寿命在特定肿瘤组织类型之间存在显着差异，但 NADH 寿命在它们之间没有显着差异。然而，与 HGG 中的致密肿瘤相比，主要坏死区域的 NADH 寿命显着降低。我们的初步研究表明，NADH/PPIX 的组合荧光寿命成像是一种灵敏的工具，可以显示传统 5-ALA 荧光无法检测到的脑肿瘤组织。

图文节选（1）

图1. 具有相应组织学特征的肿瘤组织的代表性 NADH 和 PPIX 荧光强度和寿命图——这里我们展示了具有不同组织病理学特征的五个代表性脑肿瘤样本的荧光寿命成像。它们分别来自不同的患者，如表1所示。NADH 和 PPIX 的荧光成像是用pco.flim相机在405 nm激发下进行的。荧光测量（第2-4列）是在不同的曝光时间进行的，具体取决于荧光效率（参见强度图像中的标签）。然后使用给定的归一化因子对强度图像进行归一化以获得更好的对比度。荧光寿命图是从相对于调制激光激发的相位延迟中获得的。作为参考，我们获得了每个研究样本的组织切片（见第1列）。如图所示，与非病理组织相比，恶性组织与增加的 NADH 和 PPIX 荧光寿命有关。虽然纯荧光强度成像也显示了主要的肿瘤浸润区域，但荧光寿命图提供了对低荧光组织的更强可视化能力。（感兴趣的区域：*非常高的NADH荧光寿命是组织学中发现的血管的特征。**低于1 ns的 NADH 寿命仅在坏死区域中发现）。

图文节选（2）

荧光寿命成像

成像是在定制的长工作距离（250 毫米）荧光寿命显微镜上进行的，系统搭配使用调制型405 nm激光器和专用深度相机（pco.flim，PCO AG，德国），如Erkkilä等人先前报道的那样。相机由专用显微镜软件控制，并带有相机制造商提供的集成 pco.flim 插件。11 × 11 mm2 的大视野以及加长的工作距离是专门被选来以满足商用神经外科显微镜的要求的。简而言之，调制连续激光器激发荧光团，如 NADH 和 PPIX ，它们通过发射相同频率但具有寿命依赖的相位延迟的荧光而做出响应。相机通过将产生的光电子存储在两个独立的电荷箱中来检测这种相位延迟，这取决于激光在整个曝光时间内是打开状态还是关闭状态。然后可以使用两个电荷箱之间的比率来重建相位延迟以及激发激光和荧光信号之间的幅度比（称为调制幅度）。相机在激发激光的不同时间延迟下共获取16帧，以重建荧光相位延迟，然后使用具有已知寿命的对照样来作为系统参照并将相位延迟转换为寿命图。请注意，我们仅从相位延迟计算了荧光寿命，并不包括计算调制幅度。荧光分别被 (466 ± 20) nm 和 (665 ± 75) nm 的滤片针对 NADH 和 PPIX 的波段进行过滤。PPIX 和 NADH 寿命图都是通过切换相机前面的滤波片在同一位置按顺序获取的…

【关于pco.flim】

pco.flim相机系统是第一种采用Two-Tap CMOS成像芯片的荧光寿命成像相机。相机的像素和激发光间的同步使100皮秒至100微秒间的荧光衰减时间的分析成为可能。在1008 x 1008像素分辨率上，pco.flim最多可以读取45个双帧/秒，且可支持5 kHz – 40 MHz频率范围的调制。

基本参数：

1. pco.flim激光器作为落射荧光测量的光源
2. 可选择的激光波长和输出功率
3. 100 ps 到100 µs的寿命测量
4. 调制频率从5千赫兹到40兆赫
5. 500千赫兹到40兆赫外部调制信号
6. 正弦/矩形的调制信号波形
7. 像素分辨率1008 x 1008
8. 频域FLIM
9. USB 3.0接口
10. 量子效率39 %
11. 动态范围1000:1
12. 45个双帧/秒 (2 tap读出)
13. 可选曝光时间为1ms到2 s
14. 无振动水冷
15. 特殊的测量与分析软件

【关于埃赛力达科技Excelitas Technologies Corp.】

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